【摘要】目的:探討基質金屬蛋白酶9(MMP-9)對腦血管壁細胞外基質(ECM)破壞在顱內動脈瘤發病機制中的作用。方法:對15例顱內動脈瘤標本和6例非腦血管病病人的正常腦血管，應用實時熒光定量PCR檢測腦血管壁組織內MMP-9mRNA的基因表達水平，并通過電鏡觀察顱內動脈瘤病人血管壁細胞及ECM的形態學變化。結果:動脈瘤壁組織中MMP-9mRNA的表達是正常腦血管的10.06倍(P<0.01)。電鏡下見動脈瘤壁內皮細胞損傷，中層平滑肌細胞數目明顯減少并呈凋亡狀態，ECM嚴重破壞;而正常腦血管壁細胞及基質纖維清晰可見，結構完整。結論:顱內動脈瘤壁組織中MMP-9的基因表達水平顯著升高，并可能通過破壞ECM和誘導平滑肌凋亡參與顱內動脈瘤的發病機制。

【關鍵詞】顱內動脈瘤 明膠酶B 細胞外基質 顯微鏡檢查 電子 透射

近年來，國內外研究發現：動脈瘤壁組織中過度表達的基質金屬蛋白酶9(MMP-9)通過破壞腦血管壁的細胞外基質(ECM)參與顱內動脈瘤的發病。有關誘發MMP-9過度表達通路的研究較多[1-3]，但對其破壞ECM超微結構研究的報道甚少。為此，我們對顱內動脈瘤標本應用實時熒光定量PCR檢測瘤壁組織內MMP-9mRNA的基因表達水平，通過透射電鏡觀察血管壁細胞及ECM超微結構的形態學變化，并與正常腦血管進行比較，報道如下。

1、材料與方法

1.1 標本來源 15例顱內動脈瘤標本來自四川大學華西醫院神經外科近年來經開顱手術，在順利夾閉動脈瘤并保證病人安全的前提下獲取;男3例，女12例;平均年齡55歲(動脈瘤組)。同時取6例非動脈瘤病人的腦血管作為對照組，所有標本均經華西醫院病理科明確診斷。

1.2 實時熒光定量 PCR檢測

1.2.1 主要試劑：總RNA提取試劑(TrizoltotalRNAIsolationReagent，GibcoBRL，USA)、RT-PCR試劑盒(MBI公司，Lithuania)、PCR試劑盒(MBI公司，Lithuania)、Taq酶(MBI公司，Lithuania)、dNTP(MBI公司，Lithuania)、引物根據NCBIGeneBank中的人MMP-9cDNA序列(NM：004994，gi：4826835)，按照5'端相同、3'端互補的原則，兼顧Tm值、G+C含量等因素進行設計合成、純化，用無RNase的滅菌雙蒸水溶解為10mmol/L。探針由上海生工生物工程公司合成和檢測。根據甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)mRNA原始序列設計合成GAPDH(NM：002046，gi：7669491)特異的引物與探針，上游引物：5'-GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3;下游引物：5'-CCAAAGTTGTCATGGATGACCT-3'。

1.2.2 PCR反應體系和條件：MIX94℃2min變性后，進行熱循環;94℃20s、53℃30s、60℃40s收集熒光，循環次數：45次。

1.2.3 總RNA提取和mRNA分離：Trizol法提取標本細胞，總RNA紫外分光光度計分析其純度，并電泳驗證MMP-9條帶。

1.2.4 制作MMP-9基因的標準曲線：按程序進行相應模板的PCR反應和獲取熒光定量PCR，結果制作成MMP-9基因的標準曲線。將各待測樣本靶基因的相對Ct值減去內對照GAPDH的Ct值，獲得校正后的相對ΔCt值，進行統計學分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS11.5統計軟件對兩組樣本均數行t檢驗。同時比較動脈瘤組織中MMP-9與正常對照組表達水平的倍比關系。

1.4 形態學觀察 新鮮標本經3%戊二醛預固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，Epon812包埋，半薄切片光學定位，超薄切片6μm，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，行H-600IV型透射電鏡觀察。

2、結果

2.1 MMP-9mRNA在不同腦血管內的表達水平

2.2 電鏡結果 顱內動脈瘤組：內皮細胞損傷，可見細胞固縮或空泡變性，中層平滑肌細胞數目明顯減少，多數細胞核固縮，染色質邊聚，可見凋亡小體，部分線粒體腫脹，正常內部結構消失，構成細胞骨架的ECM模糊不清，呈無定形的絮狀物質，細胞缺失的部位有較多碎片(圖1);而正常對照組腦血管壁基質纖維清晰可見，結構完整。

3、討論

顱內動脈瘤的發病機制目前尚未完全清楚，通常認為是遺傳學、異常血流動力學以及血管壁后天退行性變等多種因素綜合作用的結果。國內外的研究發現：基質金屬蛋白酶(MMPs)，尤其是MMP-9與顱內動脈瘤的形成關系極為密切。劉兵等[4]運用免疫組化SP法和實時PCR檢測大鼠血管平滑肌細胞內MMP-9表達情況，結果發現：聯合應用細胞因子IL-1α和血小板源性生長因子-B(PDGF-B)能夠誘導MMP-9表達，降解膠原蛋白;結合顱內動脈瘤病人血管壁上有明顯的炎性細胞浸潤及其分泌的大量細胞因子，因此認為：過量表達的MMP-9參與了顱內動脈瘤的發生、發展乃至破裂。1997年，Kim等[1]研究顱內動脈瘤夾閉后手術切除標本發現：動脈瘤壁上MMP-9表達明顯升高，而血漿和對照組顳淺動脈壁未見升高。Gaetani等[5]研究發現：動脈瘤壁局部(而非全部)的MMP活性變化參與了顱內動脈瘤的形成和破裂。韓利江等[6]應用原位雜交技術檢測5例腦動脈瘤病人MMP-2mRNA和MMP-9mRNA的表達情況，結果發現：MMP-9mRNA在所有顱內動脈瘤標本中均有表達，陽性雜交信號密集存在于內膜，尤其是內彈力層。Sehba等[7]通過研究大鼠頸內動脈顱內分叉部穿孔誘導的蛛網膜下腔出血模型，結果發現：微血管內MMP-9表達水平在局部升高的同時伴隨Ⅳ型膠原減少或消失。本研究結果也顯示：顱內動脈瘤中MMP-9mRNA表達水平顯著性高于對照組(P<0.01)，說明過度表達的MMP-9可能參與了顱內動脈瘤的形成。

基質金屬蛋白酶(MMP)家族可由內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和巨噬細胞等多種細胞以非酶原形式合成分泌，其主要功能是降解構成ECM的膠原蛋白、彈性蛋白和非膠原糖蛋白，其中以MMP-9對ECM的破壞性最強[8]。本研究通過透射電鏡觀察到，動脈瘤血管壁內皮細胞呈固縮或空泡變性，內彈力板疏松分層或完全消失，血管壁平滑肌細胞大量凋亡，中膜主要由數量不等的纖維細胞構成，纖維細胞之間為大片膠原及無定形的絮狀物質，說明過度表達的MMP-9對ECM的破壞使血管壁變薄膨出，可能是顱內動脈瘤形成及破裂的重要機制之一。

【參考文獻】

[1] KIM S C,SINGH M, HUANG J,et al.Matrix metalloproteinase-9 in cerebral aneurysms [J]. Neurosurgery,1997, 41(3): 642-647.

[2] CROWE D L, TSANG K J, SHEMIRANI B. Jun N-terminal kinase 1 mediates transcriptional induction of matrix metalloproteinase 9 expression [J]. Neoplasia, 2001, 3(1):27-32.

[3] TAKAGI Y, ISHIKAWA M, NOZAKI K, et al. Increased expression of phosphorylated c-Jun amino-terminal kinase and phosphorylated c-Jun in human cerebral aneurysms: role of the c-Jun amino-terminal kinase/c-Jun pathway in apoptosis of vascular walls [J]. Neurosurgery, 2002, 51(4): 997-1004.

[4] 劉兵, 浦佩玉, 高永中. PDGF-B與IL-1α對大鼠動脈平滑肌細胞MMP表達影響的實驗研究[J].中國臨床神經科學,2003,11(4): 363-366.

[5] GAETANI P, RODRIGUEZY BAENA R,TARTARA F, et al.Metalloproteases and intracranial vascular lesions [J]. Neurol Res, 1999, 21(4): 385-390.

[6] 韓利江, 趙繼宗,王碩,等.人腦動脈瘤及其皮層小動脈組織72-和92-KdaⅣ型膠原酶mRNA的原位雜交研究 [J]. 中華神經外科雜志, 1999, 15(3): 156-159.

[7] SEHBA F A, MOSTAFA G, KNOPMAN J, et al. Acute alterations in microvascular basal lamina after subarachnoid hemorrhage [J]. J Neurosurg, 2004, 101(4): 633-640.

[8] GALT S W, LINDEMANN S, MEDD D, et al. Differential regulation of matrix metalloproteinase-9 by monocytes adherent to collgen and platelets [J].Circ Res,2001,89(6): 509-516.